提取RNA的步驟大致為:
使用Trizol裂解細胞。在培養板中用PBS沖洗細胞兩次,然後加入Trizol裂解細胞。對於六孔板,每孔加入1ml Trizol。
勻漿處理。如果是組織樣本,先在液氮中磨碎組織,然後加入Trizol;對於單層培養細胞,直接加入Trizol;對於細胞懸液,離心收集細胞後加入Trizol。
放置分離。將樣品在15至30℃下放置5分鐘,使核酸蛋白複合物完全分離。
加入氯仿。每使用1ml Trizol加入0.2ml氯仿,劇烈震盪15秒,室溫放置3分鐘。
離心。在4℃下,以10000rpm的速度離心10至15分鐘,樣品會分成三層,RNA主要在水相中。
沉澱RNA。將水相轉移到新管中,加入等體積的異丙醇,混勻,室溫放置20至30分鐘。
離心。在4℃下,以13000rpm的速度離心20分鐘。
洗滌RNA沉澱。用75%乙醇(用DEPC水處理過的水配製)洗滌RNA沉澱,每使用1ml Trizol至少加1ml乙醇。
乾燥RNA。室溫下晾乾RNA沉澱(大約2至3分鐘),注意不要過於乾燥。
溶解RNA。加入適量的DEPC水溶解RNA。
檢測RNA濃度和純度。使用分光光度計檢測RNA的產量和純度。
這些步驟概述了如何使用Trizol法提取RNA,這是一種常用的RNA提取方法。