螢光筆的原理主要涉及兩個方面：
螢光劑的作用。螢光筆中的顏料水溶液在毛細作用下，通過筆尖流到紙面上，留下顏色。螢光劑在顏料覆蓋下不會被光線分解，但在毛細作用下，它會滲透到紙張表面，增強顏料的螢光效果，使顏色更加明亮。
紫外螢光油墨的作用。螢光筆中的紫外螢光油墨包含具有紫外線激發的可見螢光化合物。這些化合物能吸收光能，產生原子能級躍遷，並釋放吸收的額外能量。在紫外光照射下，這些化合物能發出可見光，這是螢光筆發光的主要原因。
此外，還有一種可擦螢光筆，其墨水由螢光染料、溶劑和聚合物組成，可以通過摩擦熱或溶解原理擦除。