糖類發酵試驗的原理基於不同細菌分解糖類的能力存在差異。這些差異體現在細菌所含有的酶上，這些酶使得它們能夠發酵不同的糖類（包括醇、苷等）。在分解糖類的過程中，細菌產生的終末產物也不盡相同。一些細菌在分解糖類時會產酸和氣體（如氫氣、甲烷、二氧化碳等），而另一些則只產酸不產氣。這種產酸和產氣的差異可以用來鑑別不同的細菌。
例如，大腸埃希菌在分解葡萄糖時，由於含有甲酸脫氫酶，能夠將葡萄糖發酵生成的甲酸進一步分解為二氧化碳和氫氣，因此會產生酸和氣體；而傷寒沙門菌缺乏這種酶，所以它發酵葡萄糖時只會產生酸而不產生氣體。
在進行糖類發酵試驗時，可以通過觀察培養基的變化來判斷細菌的發酵類型。例如，接種細菌後，將培養基放置在適宜的溫度下培養一段時間，然後觀察是否有氣體產生、pH值的變化等，從而得出細菌的發酵特性。這種方法有助於區分不同種類的細菌，因為它們在分解糖類的能力上有所不同。