PacBio測序技術採用了一種獨特的邊合成邊測序（SBS）方法，這種方法依賴於DNA聚合酶和螢光標記的脫氧核苷酸（fluoro-dNTPs）來生成新的DNA鏈。具體來說，PacBio的測序過程如下：
DNA聚合酶與模板鏈結合：首先，DNA聚合酶與一條模板鏈結合，這條模板鏈可以是單鏈或雙鏈。
螢光標記的鹼基：在合成過程中，使用4種不同顏色的螢光標記的脫氧核苷酸，每種顏色的螢光標記對應一種鹼基。
鹼基配對與螢光信號變化：在鹼基配對階段，不同鹼基的加入會發出不同波長的光。通過監測這些光的顏色和強度，可以判斷進入的鹼基類型。
螢光標記的脫氧核苷酸的去除：當加入的鹼基與DNA鏈形成化學鍵後，其螢光基團被DNA聚合酶切除，導致螢光消失。
超長讀長的實現：由於這種SBS方法，PacBio能夠實現超長讀長，這主要依賴於DNA聚合酶的活性保持，而酶的活性保持受雷射對其造成的損傷影響。
此外，PacBio還升級了其測序模式，如CCS（Circular Consensus Sequencing）模式，能夠生成高保真（HiFi）的長讀長序列，如15 kb的reads，這有助於提升基因組組裝的準確性。