trizol法提取rna的步驟包括:
勻漿處理
組織:將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml Trizol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應超過Trizol體積10%。
單層培養細胞:直接在培養板中加入Trizol裂解細胞,每10平方厘米面積(即3.5厘米直徑的培養板)加1ml,用移液器吸打幾次。
將勻漿樣品在室溫放置5分鐘,使核酸蛋白複合物完全分離。
可選步驟:如樣品中含有較多蛋白質,脂肪,多糖或胞外物質等可於2-8℃ 10000g離心10分鐘,取上清。離心得到的沉澱中包括細胞外膜,多糖,高分子量DNA,上清中含有RNA。
每使用1ml Trizol加入0.2ml氯仿,劇烈振盪15秒,室溫放置3分鐘。
2-8℃ 10000g離心15分鐘,樣品分為三層。RNA主要在水相中,水相體積約為所用Trizol試劑的60%。
把水相轉移到新管中,用異丙醇沉澱水相中的RNA。每使用1ml Trizol加入0.5ml異丙醇,室溫放置10分鐘。
離心前可以在管的側壁和底部看到絮狀膠樣沉澱,這就是RNA沉澱。
去上清,加入75%乙醇洗滌RNA沉澱。振盪器混勻後,2-8℃下7500g離心5分鐘。
去上清,置真空或空氣中5-10分鐘,乾燥RNA沉澱。注意不能將RNA沉澱完全乾燥,這樣會降低它的溶解度。然後用無RNase水或0.5%SDS溶液重懸RNA沉澱,用槍頭反覆吹打幾次,靜置10分鐘,55-60℃溶解RNA,測濃度後於-20℃保存。