三引物法的原理是基於聚合酶鏈反應（PCR）的一種基因型鑑定方法。具體來說，這種方法涉及到三條引物的設計：
左引物（Left genomic primer，LP）：位於T-DNA的上游基因組序列上，也就是5'端。
右引物（Right genomic primer，RP）：位於T-DNA的下游基因組序列上，也就是3'端。
中間引物（Between primer，BP）：位於T-DNA上。
通過這三條引物的組合，可以區分不同的基因型：
如果只有左引物（LP）和右引物（RP）的組合能夠擴增出PCR產物，那麼該植株為野生型（WT），因為此時沒有T-DNA的插入。
如果左引物（LP）和右引物（RP）的組合不能擴增出PCR產物，但中間引物（BP）和右引物（RP）的組合能夠擴增出PCR產物，那麼該植株為純合突變體（aa），因為T-DNA已經插入到基因組中。
如果左引物（LP）和右引物（RP）的組合以及中間引物（BP）和左引物（LP）的組合都能擴增出PCR產物，那麼該植株為雜合突變體（Aa），因為有T-DNA的插入，並且左右兩側的基因組序列都可以被擴增。
這種方法允許在同一PCR反應中同時使用這三條引物，或者分成兩個反應來進行，以提高擴增效率。最常用的BP引物位於T-DNA的3'端，與右引物RP進行組合。通過這種方式，可以有效地鑑定出野生型、純合突變體和雜合突變體。