不可逆抑製作用是指抑製劑與酶分子的必需基團以共價鍵結合，導致酶活性喪失，並且這種結合非常牢固，無法通過透析、超濾等物理方法將其去除，從而使酶活性無法恢復。這種抑製作用是不可逆的，因為它涉及到酶的永久性失活。例如，有機磷農藥對絲氨酸酶的抑制就屬於專一性不可逆抑制，其中有機磷農藥與膽鹼酯酶的必需基團絲氨酸羥基結合生成磷醯化膽鹼酯酶，導致酶失活。另一種不可逆抑製作用的例子是重金屬離子如汞、銀和砷對疏基酶的抑制，這些離子可以與酶分子中的疏基發生不可逆結合，從而抑制酶活性。這種抑製作用是非專一性的，因為重金屬離子可以與酶分子中的多種基團結合。