二胡的定弦通常採用純五度定弦法，其兩根弦分別是內弦和外弦，在定弦時，外弦通常定為國際標準音A音（440赫茲），內弦則定為D音。
定弦時，可以使用二胡專用的弦軸，將弦軸固定在二胡的頭部，然後將弦通過弦軸上的孔穿過並拉緊。定弦的過程中，可以使用調音器或校音器來輔助，對於電子調音器，需要將其夾在琴頭上，然後先調內弦到D音，再調外弦到A音。在調整過程中，如果調音器的指針偏右，則表示音偏高，需要調低；如果指針偏左，則表示音偏低，需要調高，直到指針指向調音器螢幕的正中間，此時音高就準確了。
此外，在定弦後，還需要檢查琴弦的鬆緊度，確保琴弦不過緊或過松，以保證演奏的舒適度和音質的準確性。