分子螢光光譜原理涉及分子在吸收特定波長的光後，電子從基態躍遷至激發態，隨後電子返回到基態並發射出光子的過程。這個過程可以細分為幾個關鍵步驟：
分子吸收光子。處於基態的分子吸收特定波長的光子，電子從基態躍遷至激發態。這個躍遷可以是單線激發態或三線激發態，其中單線激發態的電子自旋方向不改變，而三線激發態涉及電子自旋方向的改變。
電子去活化。處於激發態的分子不穩定，會通過各種途徑（如振動弛豫、內轉換、系間跨躍等）消耗多餘的能量，返回基態。這個過程稱為去活化過程。
螢光發射。在去活化過程中，分子可以通過輻射躍遷的方式（即發射螢光）返回基態。螢光發射涉及電子從激發態的較高能級躍遷回基態，同時釋放出能量。
螢光光譜的測量通常涉及使用不同波長的光激發樣品，並記錄發射的螢光強度和波長。這樣得到的螢光光譜可以提供關於分子結構和性質的信息。螢光光譜的原理和套用在化學、生物學和醫學等領域有著廣泛的套用，包括分析化學中的螢光分析法。