去硝化作用，也稱為反硝化作用或脫氮作用，是一種生物化學過程。在這個過程中，細菌在無氧條件下，將硝酸鹽(NO3-)中的氮(N)通過一系列中間產物(NO2-、NO、N2O)還原為氮氣(N2)。這一過程是硝酸鹽呼吸的兩種途徑之一，另一種途徑是硝酸異化還原成銨鹽(DNRA)。
反硝化作用需要具有反硝化微生物，適合的電子供體如含碳化合物、還原型硫化物和氫等，無氧環境條件以及含氮氧化物。在反硝化過程中，電子從「還原性」的電子供體物質通過一系列電子載體傳遞給一個氧化性更高的氮氧化物。當電子傳遞給某幾個氮氧化物時，能量被電子轉移磷酸化作用形成ATP。其終產物則因不同的作用菌而有所不同。
參與反硝化作用的微生物在自然界普遍存在，例如脫氮小球菌、反硝化假單胞菌等，它們以有機物為氮源和能源，進行無氧呼吸。反硝化作用中的還原酶包括硝酸還原酶(NaR)和亞硝酸還原酶(NiR)。
反硝化作用是碳循環的重要一環，有兩種完全不同的用途，一是利用其中的氮作為氮源，稱為同化性硝酸還原作用；另一用途是利用NO2-和NO3-為呼吸作用的最終電子受體，把硝酸還原成氮(N2)，稱為反硝化作用或脫氮作用。