固定化酶的方法主要有四種，包括吸附法、包埋法、共價鍵結合法（化學結合法）和交聯法。具體如下：
吸附法。這種方法利用各種固體吸附劑將酶或含酶菌體吸附在其表面，常用的吸附劑包括活性炭、氧化鋁、矽藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、矽膠、羧基磷灰石等。操作簡便、條件溫和，不會引起酶的變性失活，載體價廉易得，可反覆使用。但酶與載體結合不太牢固，易脫落。
包埋法。在包埋法中，將聚合物的單體與酶溶液混合，再藉助於聚合助進劑作用進行聚合，酶被包埋在聚合物中以達到固定化。這種方法操作簡單，可製得較高活力的固定化酶，適用於小分子的酶。
共價鍵結合法。在共價鍵結合法中，酶蛋白側鏈基團和載體表面上的功能基團之間形成共價鍵而固定的方法。這種方法製得的固定化酶穩定性好，但製備過程中反應條件較為強烈，易使酶變性失活，且製作手續繁瑣。
交聯法。交聯法使用雙功能或多功能試劑在酶分子間或酶與載體間、或酶與惰性蛋白間進行交聯反應以製得固定化酶。常用的試劑包括戊二醛、己二胺、順丁烯二酸酐、雙偶氮苯等，其中套用最廣泛的是戊二醛。這種方法製備的固定化酶結合牢固，可長時間使用。但由於交聯反應較激烈，酶分子的多個基團被交聯，導致酶活力損失較大。