引物二聚體是PCR反應中常見的副產品,主要由以下原因形成:
引物之間或引物自身的3』端部分鹼基互補結合,在Taq酶作用下從3』端延伸形成的小分子量雙鏈DNA片段。
模板量過低、引物濃度過高、引物長度過短、退火溫度低、循環次數過高。
消除引物二聚體的方法包括:
重新設計引物,避免引物之間或自身的3』端部分存在過多的互補鹼基。
增加模板使用量。
降低引物濃度。
提高退火溫度。
減少循環次數。
在反應混合物中加入少量的甘油或DMSO。
進行PCR反應時,確保在冰上配製反應混合物,並在PCR結束後避免產物在室溫下放置過長時間。
使用特定的引物設計軟體(如Primer 5)來識別和避免可能形成引物二聚體的序列。