戊二醛的消毒原理主要是依靠其兩個活潑的醛基。
戊二醛可以通過破壞微生物細胞膜的結構和功能，或與微生物體內的蛋白質發生反應，從而導致細胞死亡。具體來說，戊二醛的殺菌效果與其所處的環境條件有關，如pH值和溫度。在酸性環境下，戊二醛單體較少，生物活性較低，但在酸性條件下聚合作用較慢，因此較穩定。在鹼性環境下，戊二醛的生物活性較高，能夠殺滅包括芽孢在內的多種微生物，但聚合作用不可逆，隨著聚合體的增多，其活性逐漸減弱或消失。
此外，戊二醛還通過與菌體蛋白的巰基、羥基、羧基和氨基發生反應，引起蛋白質凝固，進而造成細菌死亡。