抗酸性染色法的原理基於分枝桿菌細胞壁的特殊成分，即分枝菌酸，這種物質與染料結合後很難被酸性脫色劑脫色。
在抗酸性染色法中，通常使用石炭酸復紅作為染料，這種染料能與分枝菌酸牢固結合，形成難以被3%鹽酸酒精脫色的複合物。在染色過程中，標本先被石炭酸復紅染色，然後經過加熱處理以促進染色劑的滲透和結合。接著使用3%鹽酸酒精進行脫色處理，此時，抗酸性細菌由於分枝菌酸的存在，能夠保持原有的紅色，而非抗酸性細菌則被脫色，並在後續的鹼性美藍復染過程中呈現藍色。
這種方法主要用於區分抗酸性和非抗酸性細菌，特別是在診斷如結核分枝桿菌和痲風分枝桿菌等疾病中具有重要意義。