抗酸性染色的原理主要基於分枝桿菌細胞壁中特殊的成分，即分枝菌酸。這種物質與紅色染料復紅結合後，能夠抵抗酸性酒精的脫色作用，因此呈現抗酸性染色的特徵。分枝桿菌的細胞壁內含有大量的脂質，這些脂質包圍在肽聚糖的外面，使得分枝桿菌不易著色。為了促使分枝桿菌著色，需要經過加熱和延長染色時間。當分枝菌酸與染料結合後，它們形成的複合物很難被酸性脫色劑脫色，這就是抗酸染色的名稱由來。
在齊-尼氏抗酸染色法中，加熱條件下分枝菌酸與石炭酸復紅結合成複合物，這種複合物即使在鹽酸酒精處理下也不脫色。隨後，當加上鹼性美蘭復染後，分枝桿菌仍然保持紅色，而其他細菌及背景中的物質則被染成藍色。這種方法是一種常用的細菌學染色方法，用於檢測和診斷細菌感染。