柯勒照明的原理是通過一系列透鏡和光闌的組合，使得光源的像成在物鏡的入瞳面上，同時將樣品平面與視場光闌共軛，從而在樣品平面上獲得均勻的平行光照明。具體來說，柯勒照明系統包括光源、聚光鏡、視場光闌和樣品平面。光源經過聚光鏡後，其像在孔徑光闌處成像，而孔徑光闌又位於聚光鏡的焦平面上，因此光源的像在經過聚光鏡後以平行光出射，均勻照明在樣本上。由於光源上每一點發出的光最終都以平行光出射到樣本上，所以光源的均勻性不影響樣本的照明均勻性。柯勒照明常用於非均勻光源（例如鎢絲燈）的照明，因為它能夠提供均勻而又充分明亮的照明，同時避免產生耀眼的眩光，使得顯微鏡的使用人員可以發掘出顯微鏡的所有潛在能力。