琵琶的定弦通常採用標準定弦法，即A、d、e、a定弦。這種定弦方式適用於多種調式，包括C調、D調、F調、G調、A調等。在C調中，琵琶的定弦為6、2、3、6；在D調中，定弦為5、1、2、5；在F調中，定弦為3、6、7、3；在G調中，定弦為2、5、6、2；在A調中，定弦為1、4、5、1。如果樂曲定調為降A、降G、降D，可以在標準定弦的基礎上將四根空弦均下調半音，以將調式轉為降調。
琵琶有四根弦，初學者多使用D調。在定弦過程中，可以使用雙弦法來校準琴弦的音準。例如，要校準二弦時，可以摁住一弦並彈奏兩根弦，如果聲音相同則表明二弦準確。以此類推，可以校準三弦和四弦的音準。