益生菌的製作方法多樣，主要可以分為以下幾種：
液體發酵法。首先選擇優良菌種，然後在適當的培養基中接種菌株，經過恆溫、搖床等條件進行培養，使菌株繁殖成數目龐大的菌群，之後通過不同的分離技術將所需的菌群從培養基中分離出來，並進行純化處理，去除雜菌和不需要的微生物，保留有益的菌種，最後將純化後的菌株製成口服固體或液體製劑，如益生菌膠囊、飲料等。在整個生產過程需要嚴格控制溫度、濕度、時間等多個參數，以確保菌株的純度和活性。
固體表面發酵法。這種方法是把固體表面培養的菌泥與載體按比例混合經乾燥製成，適用於生產固體形態的益生菌產品。
家庭自製法。如自製優酪乳，將牛奶加熱至約80°C後冷卻至40°C左右，加入適量的優酪乳菌種攪拌均勻，然後倒入乾淨的玻璃容器中密封，放入預熱過的烤箱中保持恆溫約40°C發酵6~12小時。
農業套用法。使用玉米麵、小麥粉、豆粕等飼料原料，混合後蒸煮，加入益生菌菌種，然後放入發酵罐中進行發酵，完成後可用於餵養寵物或作為飼料添加劑。
以上方法展示了益生菌製作的多樣性，從工業生產到家庭自製，每種方法都有其特點和適用場景。