硫磺的作用原理主要包括以下幾個方面：
氧化作用。硫磺在高溫下能與氧氣反應生成二氧化硫，從而起到氧化作用。
還原作用。硫磺遇到氫氣或鹼金屬時，可以被還原為硫化物，發揮還原作用。
消毒作用。硫磺燃燒時能產生二氧化硫，可用於消毒、殺菌等場合。
硫化作用。硫磺可以與許多金屬反應生成對應的硫化物，如鐵的硫化物FeS、銅的硫化物Cu2S等。
在中醫中的套用。硫磺在中醫中被定為「火中精」，口服硫磺能氧化組織內的一氧化氮，減少一氧化氮的生成，並形成不溶於水的一氧化硫，使一氧化氮不能隨水分進入細胞，而溶於水的氧氣可進入細胞而產熱。
殺菌消炎作用。硫磺具有較強的殺菌、消炎作用，可用於治療各種細菌和真菌感染引起的皮膚病。
止癢作用。硫磺能夠刺激皮膚神經末梢，減輕皮膚瘙癢和疼痛。
補火助陽作用。硫磺在中醫理論中屬於溫性藥物，具有補火助陽的作用，可用於治療陽痿、遺精、月經不調等症狀。
通便作用。硫磺具有潤腸通便的作用，可用於治療便秘和腸道寄生蟲病。
在藥理學中的套用。硫磺內服後變為硫化物或硫化氫，刺激胃腸黏膜，使之興奮蠕動，導致下瀉。
殺菌原理。硫磺能作用於病菌氧化還原體系中細胞色素b和c之間的電子傳遞過程，干擾正常的氧化一還原，而導致病菌死亡。