自磷酸化（autophosphorylation）是一種化學反應，狹義上指蛋白質分子中的胺基酸殘基被自身激酶活性催化，進行磷酸基修飾的過程。廣義上，自磷酸化還包括同（源）二聚體蛋白激酶的兩個單體相互催化的磷酸基修飾。
磷酸化和去磷酸化是調節蛋白質功能的一個重要途徑，由激酶催化。如果激酶催化磷酸連線到自身的基團上，就叫自身磷酸化。在生物體中，往往通過這種磷酸化調節蛋白激酶的活性，在信號轉導途徑中起重要作用。例如，當配體-受體結合時，受體胞外結構域構象變化導致相鄰的單跨膜受體二聚化，以利於受體間的互動磷酸化，即自磷酸化。