DNA水解酶主要作用於DNA分子的磷酸二酯鍵。 這種酶能夠將連線脫氧核糖核苷酸的磷酸二酯鍵打開，從而釋放出四種不同的核苷酸，即腺嘌呤脫氧核苷酸(A)、鳥嘌呤脫氧核苷酸(G)、胞嘧啶脫氧核苷酸(C)和胸腺嘧啶脫氧核苷酸(T)。