高效液相色譜（HPLC）的工作原理主要基於樣品中各組分在固定相和流動相之間的相互作用差異。
高效液相色譜法使用液體作為流動相，並採用高壓輸液系統將流動相泵入裝有固定相的色譜柱中。固定相通常是由極細的顆粒材料構成，能夠與樣品中的各組分發生相互作用，如吸附、分配、離子吸引等。這些相互作用導致不同組分在色譜柱中的不同移動速度和保留時間，從而實現分離。樣品溶液經進樣器進入色譜柱後，被分離成單個組分，依次流出並通過檢測器，如紫外檢測器、螢光檢測器或電化學檢測器等，將樣品濃度轉換成電信號並記錄下來，形成色譜圖。
高效液相色譜法具有高分離度、高靈敏度、快速分析等特點，適用於分析高沸點、不易揮發、受熱不穩定以及分子量大的有機化合物。HPLC廣泛套用於生命科學、食品科學、藥物研究以及環境研究等領域。