NBT（氮藍四唑）的原理主要基於其作為脫氫酶和其他氧化酶的顯色底物，可以被還原以產生有色甲臢衍生物。當NBT被還原時，它可以與超氧陰離子反應，形成不溶於水的藍色化合物，從而定位組織中的超氧陰離子。超氧陰離子是一種活性氧，屬於含氧自由基，能夠催化NBT的還原反應。此外，NBT也可以作為NADPH黃遞酶的底物，與5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸鹽（BCIP）結合用於檢測鹼性磷酸酶。
在生物化學實驗中，NBT可以用於檢測酶活性。例如，超氧物歧化酶（SOD）可以清除超氧陰離子自由基，從而抑制NBT在光下的還原作用。當有氧化物質存在時，核黃素可以被光還原，產生的O2-可以將NBT還原為藍色甲腙，後者在560nm處有最大吸收。因此，光還原反應後，反應液藍色愈深，說明酶活性愈低，反之酶活性愈高。