β-氧化作用，也稱為脂肪酸的β-氧化，是體內脂肪酸分解的主要途徑，它涉及脂肪酸的活化、轉移、β-氧化以及最終的徹底氧化生成二氧化碳和水並釋放能量。具體過程如下：
脂肪酸的活化：在ATP、CoA-SH、Mg2+存在下，脂肪酸被脂醯CoA合成酶催化生成脂醯CoA。這一過程不僅使脂肪酸成為高能化合物，而且提高了其水溶性，增強了代謝活性。
脂醯CoA的轉移：由於長鏈脂醯CoA不能直接透過線粒體內膜，它們需要藉助肉鹼（L-3羥-4-三甲基銨丁酸）被轉運入線粒體內。線上粒體內膜的外側及內側分別有肉鹼脂醯轉移酶I和酶Ⅱ，它們為同工酶，負責脂醯CoA的轉移。
β-氧化過程：在脂肪酸β-氧化多酶複合體的催化下，脂醯CoA依次進行脫氫、水化、再脫氫和硫解四步連續反應。這一過程釋放出一分子乙醯CoA和一分子比原來少兩個碳原子的脂醯CoA。由於反應均在脂醯CoA的β-碳原子與β-碳原子間進行，最後β-碳原子被氧化成醯基，故稱β-氧化。
乙醯CoA的後續代謝：新產生的乙醯CoA大多進入線粒體基質中脫羧脫氫，進而被檸檬酸合成酶催化產生檸檬酸，參與三羧酸循環（又名Kreb循環或檸檬酸循環）。乙醯CoA和乙醯輔酶A在肝臟內可以縮合生成乙醯乙酸，而肝臟不能利用酮體，必須將酮體運至肝外組織，如肌肉和腎臟，再轉變為乙醯CoA而被氧化利用。
β-氧化是脂肪酸代謝的關鍵步驟，它不僅為機體提供所需的能量，還能將長鏈脂肪酸改造成長度適宜的脂肪酸，供機體代謝所需。