反硝化作用，也稱為脫氮作用，是指在厭氧條件下，某些微生物將硝酸鹽及亞硝酸鹽還原為氣態氮氧化物（如一氧化二氮N2O）或氮氣N2的過程。這一過程是活性氮以氮氣形式返回大氣的主要生物過程，對於碳循環和氮循環都是重要的環節。
反硝化作用不僅在土壤中進行，還可在江河、湖泊和海洋中進行。發生反硝化作用的條件包括合適的電子供體（如有機碳化物、還原碳硫化物）、厭氧條件以及氮的氧化物。參與這一過程的微生物主要是反硝化菌，這些細菌在無氧條件下，通過將硝酸鹽作為電子受體完成呼吸作用以獲得能量。大多數反硝化細菌是異養型細菌，也有少數是自養型細菌，如反硝化硫桿菌。
反硝化作用在農業生產上具有雙重作用，一方面可以通過減少土壤中氮素營養的含量，有利於控制氮素流失和減少硝酸鹽積累對生物的毒害作用；另一方面，反硝化作用產生的氮氣可以減少土壤中因淋溶而流入河流、海洋中的NO3-，從而減輕水體富營養化的問題。