基因敲入（gene knock in）是一種分子生物學技術，它通過同源重組將外源的有功能基因（基因組原先不存在或已失活的基因）轉入細胞與基因組中的同源序列進行重組，插入到基因組中，在細胞內獲得表達。這種技術有兩種主要形式：
原位敲入。在原基因敲除的位點插入新基因，是基因敲除的逆過程。
定點敲入。無論敲除基因的位點在哪裡，敲入的基因在特定啟動子下，以轉移載體的形式轉座進去，所以插入的位點是特定的。
基因敲入通常涉及以下步驟：
針對目標基因進行精細分析以確定準確的靶位點，並進行gRNA（guide RNA）的設計。
構建敲入載體，包括Cas9-gRNA表達質粒和供體DNA。
構建基因敲入細胞株，依據所要編輯的細胞選擇合適的Cas9、gRNA和donor導入方式（例如脂質體、電轉或病毒包裝）。
通過抗生素篩選後，對分離得到的細胞克隆進行測序，以驗證基因敲入的效果。
利用96孔板對單克隆進行進一步的篩選，並進行測序分析，以選取純合的敲入細胞株。
此外，CRISPR/Cas9系統也常用於實現基因敲入，通過sgRNA識別並結合目標基因的靶向序列，引導Cas9對結合位點進行剪下，產生DNA雙鏈斷裂，然後通過細胞內的同源重組修複方式，將外源供體DNA定點導入至基因組的靶位點中。