多肽合成的原理主要基於固相肽合成（SPPS）技術，這項技術由R. Bruce Merrifield發明，並在1984年使他獲得了諾貝爾獎。該技術通常涉及以下步驟：
連線胺基酸。首先，將N端的胺基酸（通常是羧基端的胺基酸）通過共價鍵與不溶性的高分子樹脂連線。這一步驟中，胺基酸的α-氨基通常會用Fmoc（9-芴甲氧羰基）或BOC（叔丁氧羰基）等保護基團保護。
去除保護基團。使用鹼性溶液，如六氫吡啶DMF溶液，去除α-氨基上的Fmoc保護基團，使得α-氨基裸露。
縮合反應。然後加入第二個（或後續）胺基酸，該胺基酸的側鏈基團也用相應的對酸敏感的保護基團保護。在縮合劑的作用下，裸露的α-氨基與第二個胺基酸的羧基交聯，形成肽鍵，從而延長肽鏈。
檢測與純化。通過檢測（如茚三酮檢測）確保所有的胺基酸都已完全反應。如果檢測到有裸露的α-氨基，說明反應不完全，需要重複上述步驟。反應完全後，用酸（如三氟乙酸）將肽鏈從樹脂上切割下來，同時去除側鏈上的保護基團，得到多肽粗品。最後，通過純化等處理得到所需的多肽。
這種固相合成方法的特點是從C端（羧基端）向N端（氨基端）逐步合成肽鏈，確保了正確的胺基酸序列。