定氮法的基本原理是將蛋白質等含氮有機物樣品與濃硫酸和催化劑一起加熱消化，使蛋白質分解，其中的碳和氫元素被氧化成二氧化碳和水，而氮元素則轉化為氨，氨與硫酸反應生成硫酸銨。
在凱氏定氮法中，這一過程通常稱為「消化」。然後，通過加入強鹼並蒸餾，使硫酸銨分解出氨，並用硼酸吸收。之後，使用標準無機酸（如硫酸或鹽酸）滴定，直到溶液中的氫離子濃度恢復至原來狀態。根據酸的消耗量，可以計算出樣品中的總氮量，進而推算出蛋白質的含量。
此外，還有一種稱為杜馬斯法的方法，它是在高溫下燃燒樣品，使氮元素以分子氮的形式釋放，然後通過熱導檢測器檢測氮的含量。