慢病毒包裝的步驟通常包括以下幾個階段:
準備細胞和質粒。使用293T細胞,並準備包裝混合質粒和表達質粒。包裝混合質粒通常包括pMD.G/pMD2.G和pCMV8.9/psPAX2,而表達質粒則包含目的基因。
質粒與轉染試劑的準備。將質粒和轉染試劑(如脂質體2000或PEI)分別溶於無血清培養基中,然後輕柔混合併室溫孵育。
細胞轉染。用胰酶消化293T細胞,並用含血清的培養基重懸。在六孔板中加入含血清的生長培養基,然後加入DNA-脂質體複合物。接著,將重懸的293T細胞加入到平板中,並在37°C、5% CO2的孵箱中孵育過夜。
更換培養基。移除含有DNA-脂質體複合物的培養基,換上新鮮的DMEM培養基(含丙酮酸鈉和非必須胺基酸)。
收集病毒上清液。轉染後48~72小時,收穫含有病毒的上清液。通常通過離心去除細胞碎片和未包裹的病毒,然後病毒上清液儲存在-80°C。
病毒滴度測定和套用。包裝出的慢病毒對NIH/3T3細胞等具有高感染效率,可用於目的細胞的轉導和基因功能研究。
這個過程需要一定的實驗技巧和條件,包括適當的細胞培養技術、質粒準備、以及轉染技術的掌握。此外,使用特定的慢病毒包裝試劑盒(如ViralStars LP Lentivirus Packaging Kit)可以簡化這一過程,並提高病毒的產量和質量。