脂肪酸的氧化作用是一種在生物體內廣泛存在的代謝過程，主要發生在肝臟和肌肉中，而在神經組織中的氧化程度相對較低。這個過程可以分為三個階段：
活化。脂肪酸首先需要被活化，形成硫酯形式的脂醯CoA，這一過程由脂醯CoA合成酶催化，活化後的脂肪酸易於溶於水，並具有高能鍵和活潑的化學性質，成為酶的特異底物。
轉移。長鏈脂醯CoA需要進入線粒體進行氧化，這一過程通過肉鹼脂醯轉移酶實現，這些酶分布線上粒體的內外膜上，長鏈脂肪酸在胞漿中轉化為脂醯肉鹼，然後通過肉鹼和肉鹼脂醯轉移蛋白進入線粒體基質。
β-氧化。線上粒體基質中，長鏈脂肪酸經歷多次β-氧化反應逐步降解成乙醯CoA，這一過程涉及脫氫、加水、再脫氫和硫解等步驟，每進行一次β-氧化，脂醯CoA減少兩個碳原子，最終生成較原來少兩個碳原子的脂肪酸。
此外，脂肪酸氧化過程中生成的乙醯CoA不僅是重要的能量來源，也是許多重要化合物合成的原料，如酮體、膽固醇和類固醇化合物。