酯酶活性的測定通常涉及以下幾種方法：
滴定法。這是一種傳統的方法，用於測定酯化力。首先，使用鹼來中和酯化液中的游離酸，然後加入過量鹼使酯皂化。使用酚酞作為指示劑，用酸進行反滴定。這種方法操作複雜、耗時長。後來，使用正庚烷作為有機溶劑，建立了有機相反應體系，以快速測定酯化力。
紫外光譜法。通過膽鹼酯酶的催化反應，生成有色產物，如5,5′-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）(DTNB)，然後進行紫外分析。
螢光光譜法。利用酶催化反應直接或間接生成具有螢光的產物進行檢測。
同位素標記法。使用14C或3H標記的底物，如ATP，進行檢測。
等溫滴定量熱法。對天然底物進行量熱分析。
電化學方法。如計時電位法，通過測量碘化乙醯硫代膽鹼在鉑電極上的電位變化來測定酶活性。
此外，在實驗測定乙醯膽鹼酯酶活性時，應嚴格控制保溫時間、溫度和樣品溶液的pH值，因為這些因素對酶活有顯著影響。