芥子油的主要成分是多種有機異硫氰酸酯化合物。
這些化合物具有揮發性和刺激性。芥子油是通過將芥子種子與水、醋或其他液體混合研磨後產生的，或者直接咀嚼食用時釋放的。這種油含有超過92%的烯丙基異硫氰酸酯，這種成分的刺激性是由於感覺神經元的TRPA1離子通道被活化。芥子油中還含有多種脂肪酸的甘油酯，如芥酸、廿碳烯-11-酸、油酸、亞油酸、亞痲酸、棕櫚酸、花生酸、硬脂酸和山嵛酸等。
此外，芥子油還包含一些化妝品成分，如維生素A、維生素E和胡蘿蔔素，這些是脂溶性的。芥子油苷是芥子油中的另一種重要成分，根據芥子油苷分子中側鏈的不同，芥子油苷分為脂肪族芥子油苷、吲哚族芥子油苷和芳香族芥子油苷。