蜘蛛可以通過多種方法進行性別鑑別，以下是幾種常用的方法：
觀察蜘蛛的蛻皮。在蜘蛛蛻皮後，檢查其腹部。如果腹部中間有一個明顯的小片，則是雌性；如果是一個光滑的區域，則是雄性。這種方法適用於各種大小的蜘蛛，但在顯微鏡下觀察會更加清楚。
觀察蜘蛛的腿和牙的比例。比較蜘蛛第二和第三對足的長度，雌雄在腿的比例上有所不同。雄性蜘蛛的第三和第四節比例差距較大，且第四節比第三節要長且細，兩節相接處有明顯轉折；雌性蜘蛛這兩節的比例差較小，銜接處較流暢豐滿。
檢查蜘蛛的外形和花紋。雌性蜘蛛的花紋通常只有一種白色，而雄性蜘蛛在白色花紋中還有黑色花紋。
觀察生殖器的特徵。成熟雌蛛的生殖口特化成較硬的構造，稱作外雌器；而雄蛛在成熟後，其毒牙旁的觸肢末端會有一個精栓，且第一對步腳的脛節上會有一根小凸起物。
觀察蜘蛛的體型。雌性蜘蛛體型較大，觸肢及步足粗壯有力；雄性蜘蛛體型較小，腹部小步足細長。
這些方法可以單獨使用，也可以結合使用來更準確地鑑別蜘蛛的性別。