蜘蛛的雌雄性別可以通過以下幾種方法進行辨別：
體型和顏色。雌性蜘蛛通常略大於雄性蜘蛛，儘管某些品種之間的體型差異可能較大。在顏色方面，雄性蜘蛛的身體顏色可能較為鮮艷和有光澤，而雌性蜘蛛則相對暗淡。
腹部構造。觀察蜘蛛腹部的構造也是一個辨別方法。例如，在紅玫瑰蜘蛛中，成熟雌性的生殖口呈現較硬的構造，而雄蛛在成熟後，其毒牙旁的觸肢末端會出現一個精栓，第一對步腳的脛節上會有一根小凸起物。
觀察蜘蛛的蛻皮。在蜘蛛蛻皮後，檢查其內側。如果四個白點中間有一個小片，則通常是雌性；如果很光滑，只有一條不明顯的細線，則是雄性。這種方法在顯微鏡下觀察時更為清楚，適用於不同大小的蜘蛛。
腿和牙的比例。觀察蜘蛛的腿和牙的比例也是一個辨別方法。例如，雄性蜘蛛的第二和第三對足的第三、四節比例差距較大，而雌性蜘蛛這兩節的比例差較小。
花紋。雌性蜘蛛的花紋通常只有一種白色，而雄性蜘蛛的花紋在白色中還有黑色的花紋。
通過這些方法，可以較為準確地辨別蜘蛛的雌雄性別。