熔解曲線分析是一種用於評估實時螢光定量PCR(qPCR)實驗結果的方法,它通過監測PCR擴增產物在逐漸升溫過程中的螢光信號變化,來分析擴增子的均一性和特異性。
在PCR擴增結束後,溫度逐漸升高至95℃的過程中,雙鏈DNA逐漸解離為單鏈,同時螢光信號強度隨之改變。這種螢光信號強度與溫度變化的關係形成了熔解曲線。在熔解曲線上,通常可以看到一個特徵峰,該峰對應的溫度是DNA雙鏈解鏈50%的溫度,即熔解溫度(Tm)。不同的DNA序列具有不同的Tm值,而且DNA中G-C含量越高,Tm值也越高。通過分析這個特徵峰,可以將特異性的擴增產物與非特異性產物(如引物二聚體)區分開來。
高解析度熔解曲線分析(HRM)是一種更先進的熔解曲線技術,它利用高靈敏度和高解析度的螢光染料,能夠檢測單個鹼基的差異。HRM分析在PCR結束後直接進行,通過監測升溫過程中螢光染料與PCR擴增產物的結合情況,記錄高解析度熔解曲線,從而對樣品中的突變、單核苷酸多態性(SNP)、甲基化、配型等進行檢測。
熔解曲線分析的主要目的是評估實時螢光定量PCR(qPCR)實驗結果的特異性和準確性。在熔解曲線上,如果出現單峰且該峰位與預期的退火溫度相符,表明擴增產物是特異性的;而出現雜峰則表明存在非特異性擴增。這種方法對於使用SYBR Green等非特異性螢光染料的qPCR實驗尤為重要,因為這些染料會與所有雙鏈DNA結合,而熔解曲線可以幫助識別是否擴增出了目標產物。