螢光顯微鏡的成像原理基於螢光現象，即某些物質在吸收特定波長的光（如紫外光）後，分子被激活，從基態躍遷至激發態，當返回基態時，以波長更長的可見光形式釋放能量，這種現象稱為螢光。螢光顯微鏡使用特殊光源，如高壓汞燈或雷射，產生足夠強度和適當波長的激發光，激發樣品中的螢光物質。
在結構上，螢光顯微鏡通常配備激發濾色鏡、聚光鏡、物鏡和阻斷濾色鏡。激發濾色鏡用於過濾掉光源中的可見光，聚光鏡將紫外光或其他激發光聚焦於樣品，物鏡放大並聚焦螢光圖像，阻斷濾色鏡阻止所有激發光的通過，只允許螢光通過。
通過這種方式，螢光顯微鏡能夠檢測和觀察樣品中特定螢光分子的存在、位置及其動態行為。這種技術在生物學、醫學研究等領域有著廣泛的套用，如觀察細胞結構、蛋白質的定位和動態變化等。