反向PCR（Reverse PCR）是一種分子生物學技術，其基本原理和步驟如下：
首先，使用限制性內切酶對樣品DNA進行切割。這些內切酶在DNA上產生黏性末端，選擇的內切酶應確保在已知序列內部沒有切點，以避免切斷未知序列。
接著，利用DNA連線酶將帶有黏性末端的DNA片段環化連線起來，形成環狀DNA分子。這一步使得已知序列成為一個環狀分子的部分。
然後，設計一對反向引物，其3'端與已知DNA序列反向互補，而5'端則具有通用引物結合位點。這些引物的3'端是相互反向的，使得PCR擴增的不是已知序列內部，而是引物外側的未知序列。
最後，通過常規PCR反應，使用上述引物進行擴增，擴增產物將包含兩個引之間的未知序列。這樣，就可以獲得與已知序列相連的未知染色體序列的信息。
反向PCR的套用包括克隆T-DNA插入位點側翼的DNA序列，以及製備酵母人工染色體（YAC）大的線狀DNA片段的雜交探針等。這項技術對於研究未知序列、基因庫染色體上DNA片段序列的識別以及轉座子插入序列的確定等方面非常重要。