夜光手錶的原理主要涉及螢光物質在光照射下吸收能量，並在暗處釋放這些能量以發光的現象。這種螢光物質通常是由基質和激活劑組成，基質提供結構支持，而激活劑（如硫化鋅）則是發光中心，當受到光激發時，電子從基態躍遷到激發態，然後在返回基態時釋放能量，產生光。
夜光手錶中的螢光物質可以是通過不同的激發方式來激發，最常見的是通過紫外線光激發。這些物質能夠在光照下吸收能量，並將這些能量儲存起來，在暗處緩慢釋放，發出微弱的光芒。
一些高端夜光手錶使用放射性物質（如氚）作為光源，這些物質能夠持續發光，但存在健康和安全問題。隨著技術的進步，現代夜光手錶越來越多地採用非放射性材料，如發光二極體（LED）和螢光粉，這些材料同樣能夠在沒有外部光源的情況下持續發光一段時間。
此外，一些手錶使用毛細管技術，通過在毛細管中注入有色磷粉和氚氣，利用氚氣的放射性發光，這種技術能夠使手錶在暗處持續發光。