巴氏染色法的原理主要涉及兩種染料的化學反應：
細胞核染色：蘇木素染液用於染色細胞核內的染色質，這些染色質主要由去氧核糖核酸（DNA）組成。DNA的雙螺旋結構中，兩條鏈上的磷酸基向外，帶負電荷，呈酸性。蘇木素是一種鹼性染料，容易與帶負電荷的DNA通過離子或氫鍵結合，從而被染色。蘇木精在鹼性溶液中呈藍色，因此細胞核被染成藍色。染色後，未結合在細胞上的染液被洗去，但細胞核中結合過多的染料和細胞漿中吸附的染料需要用分化液（如1%鹽酸酒精）脫去，以保證細胞核和細胞漿染色的分明。這個過程中，酸能破壞蘇木素的醌型結構，使色素與組織解離。分化後，蘇木精在酸性條件下處於紅色離子狀態，在鹼性條件下處於藍色離子狀態，因此需要用弱鹼性水使蘇木精染上的細胞核變呈藍色，這個過程稱為藍化作用。
細胞質染色：EA50染液由伊紅、亮綠、橘黃等酸性染料配成，這些染料在偏鹼環境中與蛋白質中帶正電的氨基結合，從而使胞漿顯藍色、綠色、橘黃色或紅色。磷鎢酸在染色過程中作為媒染劑，可增加染料的著色力，並中和分化及藍化時可能留下的少量酸或鹼，保證染色達到理想效果。
巴氏染色法適用於上皮細胞及間皮組織的標本，是陰道脫落細胞檢查中最常用的染色方法。該染色法具有顯示細胞核結構清晰、分色明顯、透明度好、胞漿受色鮮艷等特點。巴氏染色液的染色原理是利用核酸的等電點（pH1.5-2.0），當pH值大於2.0時，核酸帶負電荷，能與帶正電荷的蘇木素鹼性染料結合，呈現紫藍色。