還原糖測定的原理主要基於還原糖與銅離子在加熱條件下的反應。具體來說，將一定量的鹼性酒石酸銅（費林試劑）的甲、乙液等量混合後，會立即生成天藍色的氫氧化銅沉澱。這種沉澱會與酒石酸鉀鈉反應，生成深藍色的可溶性酒石酸鉀鈉銅絡合物。在加熱條件下，以次甲基藍作為指示劑，用樣液滴定，樣液中的還原糖與酒石酸鉀鈉銅反應，生成紅色的氧化亞銅沉澱。當二價銅全部被還原後，稍過量的還原糖會把次甲基藍還原，使其從藍色變為無色，這就是滴定終點。根據樣液的消耗量，就可以計算出還原糖的含量。
此外，樣品在測定前通常需要經過處理，如除去蛋白質等干擾物質，以保證測定的準確性。