使用MEGA軟件進行分子進化分析的步驟大致如下：
序列導入。可以通過Data或File菜單導入數據。如果是比對結果文件，選擇Analyze；如果是序列文件，選擇Align。也可以直接雙擊帶有後綴名的文件來自動導入序列。導入後，序列會在MEGA的比對界面顯示。如果導入FASTA格式的序列時出現報錯，通常是因爲序列長度不同。此時，可以新建一箇文件，然後導入序列。
多序列比對。選擇Muscle或ClustalW進行比對。ClustalW一般用於DNA序列，而Muscle多用於蛋白質序列。在比對前，需要選中要進行比對的序列（使用Shift鍵），也可以編輯序列或序列名（雙擊）。
比對參數選擇和保存。選擇合適的比對參數，並保存比對文件。進化樹分析需要使用這些數據。一般導出的比對結果保存爲FASTA格式，也可以直接保存爲二進制的MAS或MEG文件。
構建進化樹。將保存的MEG文件重新導入MEGA程序中（可以直接拖入工作界面），然後選擇構建進化樹。參數設置時，Bootstrap method一般選擇1000至1500；第一次繪圖時建議選擇500，以便快速運行，如果結果合適，再調至1000重新進行進化分析。
進化樹可視化和保存。通過ViewTree/Branch style選擇樹的模式，也可以通過右鍵圖菜單進行選擇。MEGA支持保存多種格式的文件，如Newick標準樹文件（用於下游可視化軟件導入）、PNG壓縮圖像文件和PDF矢量圖像文件。如果圖像顯示不全，可以將圖和圖注複製到WORD中保存。