PCR(聚合酶鏈反應)是一種在體外模擬細胞內DNA複製過程的分子生物學技術,其基本原理如下:
模板DNA:PCR反應需要DNA模板,這可以是任何來源的DNA,如基因組DNA(gDNA)、互補DNA(cDNA)或質粒DNA。模板DNA的組成或複雜度會影響PCR擴增的最佳起始量。
引物(Primers):引物是含有15-30個鹼基的合成DNA寡核苷酸,能夠與模板DNA中目標區域的側翼序列結合。在PCR反應期間,DNA聚合酶從3′端開始延伸引物,確保目的片段的特異性擴增。
dNTPs(核苷酸):dNTPs由四個基本核苷酸組成——dATP、dCTP、dGTP和dTTP,是新DNA鏈的組成元件。有時會使用dUTP替代dTTP,結合使用尿嘧啶DNA糖苷酶(UDG)預處理,是PCR實驗室防止殘餘PCR產物污染的重要手段。
PCR buffer(緩衝液):緩衝液用於調節反應環境的pH值,並提供適宜的反應條件。
DNA聚合酶:在體外模擬DNA複製的過程中,需要耐熱的DNA聚合酶,它以dNTP為原料,沿著模板DNA延伸引物,形成新的DNA鏈。
循環條件:PCR循環條件包括高溫變性、中溫退火和適溫延伸三個階段,這些條件的控制對於確保PCR實驗結果的特異性、重複性和靈敏度至關重要。
PCR技術利用聚合酶在體外模擬DNA複製的過程,通過不斷的擴增,使得DNA的數量呈指數級增長。這一過程依賴於細胞內DNA半保留複製的機理,以及體外DNA分子在不同溫度下雙鏈和單鏈可以互相轉變的性質。通過人為地控制體外合成系統的溫度,促使雙鏈DNA變成單鏈,單鏈DNA與人工合成的引物退火,然後耐熱DNA聚合酶以dNTP為原料使引物沿著單鏈模板延伸為雙鏈DNA。