分辨三線鼠的公母可以通過以下幾種方法:
生殖器與肛門的距離。公三線鼠的生殖器與肛門的距離較遠,且中間有毛;母三線鼠的生殖器與肛門的距離較近,兩點間沒有毛。
香腺。公三線鼠的香腺較爲明顯,尤其是在發情期時會分泌黃色分泌物;母三線鼠的香腺不太明顯。
乳房。母三線鼠的乳房比公鼠更明顯。
體型和外觀。成年公鼠通常體型較大,屁股大而圓,肛門長而大;母鼠的屁股呈倒三角形,肛門緊閉。
乳頭。從出生到大約20天時,可以通過觀察是否有乳頭來判斷性別,能看到乳頭的是母鼠。
這些特徵在幼鼠時期可能不夠明顯,但隨着它們成長,這些差異會變得更加容易辨認。