二胡的定音主要是通過琴軸裝置將內外兩根弦的音高分別固定下來，通常採用五度定音法。具體來說，二胡的常用定弦有15弦、52弦、63弦、37弦和26弦，其中15弦和52弦是基礎定弦，套用廣泛。
15弦：內弦音為"1"，外弦音為"5"，適合最低音為"1"的樂曲。如果二胡是採用的"D、A定音"，15弦奏出的樂曲調高就是"1=D"。
52弦：內弦音為"5"，外弦音為"2"，適合最低音為"5"的樂曲。如果二胡是採用的"D、A定音"，52弦奏出的樂曲調高就是"1-G"。
63弦：內弦音為"6"，外弦音為"3"，適合最低音為"6"的樂曲。如果二胡是採用的"D、A定音"，63弦奏出的樂曲調高就是"1=F"。
37弦：內空弦音為"3"，外空弦音為"7"，適合最低音為"3"的樂曲。如果二胡是採用的"D、A定音"，37弦奏出的樂曲調高就是"1='B"。
26弦：內空弦音為"2"，外空弦音為"6"，適合最低音為"2"的樂曲。
此外，二胡的定音也可以通過利用泛音來校正，以保證五度定音的準確度，並提高辨音能力。在伴奏歌唱時，還需要考慮如何保持二胡的發音特色，以及適合發揮歌唱者的嗓音性能。