ONPG（鄰硝基苯基β-D-半乳糖吡喃糖苷）試驗是一種用於快速鑑定細菌中β-半乳糖苷酶活性的方法。該試驗的原理基於某些細菌能夠產生β-半乳糖苷酶，這種酶能夠分解ONPG，生成黃色的鄰硝基酚（O-nitrophenol）。ONPG是一種無色化合物，其結構與乳糖相似，因此可以被β-半乳糖苷酶陽性微生物裂解。
在傳統的乳糖發酵試驗中，需要兩種酶的參與：半乳糖苷滲透酶和β-半乳糖苷酶。半乳糖苷滲透酶負責將乳糖分子運輸到細菌體內，而β-半乳糖苷酶則負責水解乳糖，產生葡萄糖和半乳糖。真正的非乳糖發酵菌同時缺乏這兩種酶。然而，遲緩乳糖發酵菌缺乏半乳糖苷滲透酶，但含有β-半乳糖苷酶。由於ONPG分子較小，不需要半乳糖苷滲透酶的運輸就可以進入菌細胞內，由菌細胞內的β-半乳糖苷酶將其分解。因此，通過ONPG試驗可以快速鑑定出遲緩乳糖發酵菌。
ONPG試驗對於快速鑑定隱性乳糖發酵菌（遲緩發酵菌）效果很好，因為它可以在無需滲透酶的情況下迅速滲入細菌細胞內，從而提供快速的鑑定結果。