SYBR Green I的原理主要基於它與雙鏈DNA（dsDNA）的結合特性。
當SYBR Green I與雙鏈DNA結合時，其螢光信號會顯著增強，而與單鏈DNA結合或游離狀態時，則不會發出螢光。在實時螢光定量PCR（qPCR）反應中，加入過量的SYBR Green I染料，隨著反應的進行，特異性PCR產物雙鏈DNA的量逐漸增加，SYBR Green I特異性地摻入這些雙鏈DNA中，從而發出螢光信號。由於游離的SYBR Green I不發出螢光，因此螢光信號的強度與PCR產物的數量完全同步，可以實時監測PCR過程。
此外，由於SYBR Green I與所有雙鏈DNA結合，包括特異性擴增產物和非特異性的如引物二聚體等，這可能會影響定量的準確性。但通過分析熔解曲線，可以幫助區分特異性擴增和非特異性產物，從而提高定量的準確性。