手套箱的工作原理主要基於以下幾個方面：
充入高純惰性氣體。在手套箱內充入高純度的惰性氣體（如氮氣或氬氣），並通過循環過濾系統去除其中的水分、氧氣和有機氣體等活性物質。
淨化柱的作用。箱體內的工作氣體在PLC的控制和監視下，通過管道和循環風機進行密閉循環。在工作氣體循環經過淨化柱時，其所含的水分和氧氣被吸附掉，隨著循環時間的推移，箱體內工作氣體中的水氧含量逐步減少，最終達到小於1ppm的指標。淨化柱在一定時間的循環後會吸附飽和，但可以進行再生，以便重複使用。
維持微正壓狀態。通過恆壓系統維持一個高於大氣壓的微環境，保持微正壓狀態，避免空氣和細菌從外界進入。氣體始終由操作室朝外排放，確保操作環境的安全和純淨。
過濾和消毒。手套箱對外界氣體進行高效過濾，以保證室內氣體的純度和潔淨度，避免對待操作者和樣品的污染。此外，紫外線燈消毒工藝用於確保操作室的微生物環境嚴密，殺死操作室內殘留的微生物。
通過這些綜合系統，手套箱能夠提供一個無水、無氧、無塵的超純工作環境，適用於對環境要求極為嚴格的科學研究、工業生產和醫療套用等領域。