掃描隧道顯微鏡（STM）的工作原理主要基於量子力學中的隧道效應。
其核心組件是一個極細的金屬探針，這個探針被設計成能夠在樣品表面進行掃描，同時與樣品之間保持一定的偏壓，探針的直徑要達到原子尺度。在通常的低電壓下，分離的針尖與樣品之間（相當於兩個電極）具有很大的阻抗，阻止電流通過。當針尖與樣品非常靠近時，其間的勢壘變得很薄，電子雲相互重迭。在針尖與樣品之間施加一電壓，電子就可以通過隧道效應由針尖轉移到樣品或從樣品轉移到針尖，形成隧道電流。通過記錄隧道電流的變化就可以獲得樣品表面的微觀信息。
STM有兩種主要的工作模式：恆高模式和恆流模式。恆高模式是在掃描過程中保持針尖的高度不變，測量樣品與針尖之間的隧道電流。根據隧道電流的變化可以得到樣品表面高低起伏變化的信息。恆流模式是在掃描過程中維持隧道電流不變，隨著樣品表面起伏變化，針尖也會跟著一起運動，樣品的形貌就可以由針尖上下運動的軌跡來反應。
這種顯微鏡的解析度可以達到原子水平，不僅可以獲取樣品表面的形貌信息，還可以進行原子光譜分析，甚至操控單個原子。